Espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Um instrumento de RMN de 900 MHz com uma redução de 21,1 T ímã na HWB-NMR, Birmingham, Reino Unido

Espectroscopia de ressonância magnética nuclear, mais vulgarmente conhecido como espectroscopia de RMN, é uma técnica de pesquisa que explora as magnéticos propriedades de certos núcleos atómicos . Ela determina as propriedades físicas e químicas dos átomos ou as moléculas em que estão contidos. Ele conta com o fenômeno da ressonância magnética nuclear e pode fornecer informações detalhadas sobre a estrutura, dinâmica, estado de reação, e ambiente químico das moléculas.

Na maioria das vezes, espectroscopia de RMN é utilizada pelos químicos e bioquímicos para investigar as propriedades de moléculas orgânicas , embora seja aplicável a qualquer tipo de amostra que contém núcleos possuindo rodada. Amostras adequadas variam desde pequenos compostos analisados com 1-dimensional protões ou RMN de carbono-13, espectroscopia de grandes proteínas ou ácidos nucleicos utilizando técnicas de 3 ou 4-dimensional. O impacto da espectroscopia de RMN nas ciências tem sido substancial por causa da gama de informações e da diversidade de amostras, incluindo soluções e de sólidos.

Técnicas básicas de NMR

A amostra de RMN é preparada num tubo de vidro de paredes finas - um Tubo de RMN.

Quando colocado num campo magnético, RMN núcleos activos (tais como ¹ H ou ¹³ C) absorvem radiação electromagnética a uma frequência característica do isótopo . A frequência de ressonância, a energia de absorção, e a intensidade do sinal é proporcional à força do campo magnético. Por exemplo, em um 21 Campo magnético Tesla, protões ressoam em 900 MHz. É comum referir-se a um T 21, como um íman 900 MHz ímã, embora diferentes núcleos ressoar a uma freqüência diferente neste força do campo em proporção à sua momentos magnéticos nucleares.

Desvio Químico

Uma carga de fiação gera um campo magnético que resulta em um momento magnético proporcional à rotação. Na presença de um campo magnético externo, existem dois estados de spin (para um núcleo de spin 1/2): uma rotação para cima e uma rotação para baixo, onde se alinha com o campo magnético e o outro se opõe a isso. A diferença de energia (AE) entre os dois estados de spin aumenta à medida que a força do campo aumenta, mas esta diferença é geralmente muito pequeno, levando à exigência de ímãs fortes RMN (1-20 T para instrumentos modernos de RMN). A irradiação da amostra com a energia correspondente ao estado de rotação exacta a separação de um conjunto específico de núcleos irá causar excitação daqueles conjunto de núcleos no estado de energia mais baixo para o estado de energia mais elevado.

Para rotação 1/2 núcleos, a diferença de energia entre os dois estados de spin em uma determinada intensidade do campo magnético são proporcionais às suas momentos magnéticos. No entanto, mesmo se todos os prótons têm os mesmos momentos magnéticos, eles não dão sinais de ressonância nos mesmos valores campo / freqüência. Esta diferença decorre das diferentes ambientes eletrônicos do próton. Após a aplicação de um campo magnético externo, estes electrões mover em resposta ao campo e gerar campos magnéticos locais que se opõem ao campo aplicado muito mais forte. Este campo local, assim "protegem" o protão a partir do campo magnético aplicado, o qual deve, portanto, ser aumentada a fim de alcançar ressonância (absorção de energia RF). Tais incrementos são muito pequenas, normalmente em partes por milhão (ppm). A diferença entre 2.3487T e 2.3488T é, portanto, cerca de 42ppm. No entanto, uma escala de frequências é utilizada para designar os sinais de RMN, apesar de o espectrómetro pode operar por varrer o campo magnético, e, portanto, a 42 ppm é de 4200 Hz para uma frequência de referência de 100 MHz (RF).

No entanto, dado que a localização de diferentes sinais de RMN depende da intensidade do campo magnético externo e a frequência de RF, os sinais são normalmente apresentada em relação a um sinal de referência, geralmente o de TMS ( tetrametilsilano). Além disso, uma vez que a distribuição de sinais de RMN é dependente de campo, estas frequências são divididos pelo espectrómetro de frequência. No entanto, uma vez que estão a dividir pelo Hz MHz, o número resultante seria demasiado pequena e, portanto, é multiplicado por um milhão. Por conseguinte, esta operação dá um número de localizador chamado de "desvio químico" com unidades de partes por milhão. Para detectar estas diferenças pequenas de frequência do campo magnético aplicado deve ser constante em todo o volume da amostra. Alta resolução espectrômetros RMN usar calços para ajustar a homogeneidade do campo magnético de partes por bilião ( ppb) em um volume de poucos centímetros cúbicos. Em geral, os desvios químicos de protões são altamente previsível uma vez que os desvios são principalmente determinados por simples efeito de blindagem (densidade electrónica), mas os desvios químicos de vários núcleos pesados são mais fortemente influenciado por outros factores, incluindo estados excitados (contribuição "paramagnético" a blindagem tensor).

Exemplo do desvio químico: espectro de RMN de hexaborane B ₆ H ₁₀ mostrando picos deslocados em frequência, que dão pistas sobre a estrutura molecular. (Clique para ler detalhes de interpretação)

O desvio químico fornece informações sobre a estrutura da molécula. A conversão dos dados em bruto para esta informação é chamado de atribuição do espectro. Por exemplo, para o espectro de ¹ H-RMN para o etanol (CH ₃ CH ₂ OH), seria de esperar que os sinais em cada um dos três desvios químicos específicos: um para o grupo C H _3, um para o grupo C H ₂ e para uma o grupo OH. Um grupo típico _CH3 tem um deslocamento de cerca de 1 ppm, um _CH2 ligado a um OH tem um deslocamento de cerca de 4 ppm e um OH tem uma mudança de cerca de 2-3 ppm, dependendo do solvente utilizado.

Em Espectroscopia de RMN paramagnético, as medições são realizadas em amostras paramagnéticas. O paramagnetismo dá origem a muito diversos desvios químicos. Em espectroscopia de 1H NMR, a gama mudança chemcial pode abranger 500 ppm.

Por causa do movimento molecular à temperatura ambiente, os três protões metílicos média durante o curso da experiência RMN (que tipicamente requer alguns MS). Esses prótons se tornar degenerar e formam um pico a desvio químico a mesma.

A forma e a área dos picos são indicadores da estrutura química demasiado. No exemplo acima, o espectro de protões de etanol a-pico CH ₃ tem três vezes a área do pico como OH. Da mesma forma o _CH2 pico seria duas vezes a área do pico de OH, mas apenas 2/3 da área do pico _CH3.

Software permite a análise de intensidade de sinal de picos, que sob condições de relaxamento óptima, se correlacionam com o número de protões desse tipo. Análise de intensidade de sinal é feito por integração processo matemático -o que calcula a área sob a curva. O analista deve integrar o pico e não mede a sua altura, porque os picos também têm largura -e, assim, o seu tamanho é dependente da sua área não sua altura. No entanto, deve ser mencionado que o número de protões, ou de qualquer outro núcleo observado, só é proporcional à intensidade, ou o integral do sinal de RMN dos muito mais simples experiências de RMN unidimensional. Em experiências mais elaborados, por exemplo, experiências tipicamente utilizado para obter RMN de carbono-13 de espectros, a integral dos sinais depende da taxa de relaxação do núcleo, e as suas escalares e de acoplamento dipolar constantes. Muito frequentemente estes factores são mal conhecidos - portanto, o integral do sinal de RMN é muito difícil de interpretar em experiências de RMN mais complexos.

J-acoplamento

Exemplo ¹ H espectro NMR (1-dimensional) de etanol representados como intensidade de sinal vs. desvio químico. Existem três tipos diferentes de H átomos em etanol sobre RMN. O hidrogénio (H) na Grupo -OH não é acoplamento com os outros átomos de H e aparece como um singuleto, mas o CH ₃ - e o -CH ₂ - hidrogénios são acoplamento uns com os outros, resultando em um tripleto e quarteto, respectivamente.

Alguma da informação mais útil para a determinação da estrutura de um espectro de RMN uni-dimensional chega a partir de J-acoplamento ou acoplamento escalar (um caso especial de spin-spin acoplamento) entre núcleos ativos de RMN. Este acoplamento resulta da interacção de diferentes estados de spin através das ligações químicas de uma molécula e resultados na separação dos sinais de RMN. Estes padrões de desdobramento pode ser complexa ou simples e, da mesma forma, pode ser diretamente interpretável ou enganosa. Este acoplamento fornece uma visão detalhada sobre a conectividade dos átomos em uma molécula.

Acoplamento para n equivalente (spin ½) núcleos divide o sinal em um n +1 multipleto com rácios de intensidade seguinte triângulo de Pascal , como descrito na direita. O acoplamento para rotações adicionais conduzirá a novos lamelas de cada componente da multipleto por exemplo, acoplamento de dois rotação diferente ½ núcleos com significativamente diferentes constantes de acoplamento conduzirá a um dupleto de dupletos (abreviatura: dd). Note-se que o acoplamento entre os núcleos que são quimicamente equivalente (isto é, têm o mesmo desvio químico) não tem efeito sobre os espectros de RMN e os acoplamentos entre os núcleos que são distantes (normalmente mais do que três ligações para além de protões em moléculas flexíveis) são geralmente muito pequeno para causar splittings observáveis. acoplamentos de longo alcance durante mais de três ligações muitas vezes podem ser observadas em e cíclico compostos aromáticos, que conduzem a padrões de desdobramento mais complexas.

Por exemplo, no espectro de protões para o etanol descrita acima, o grupo CH ₃ é dividido em um tripleto, com uma razão de intensidades de 1: 2: 1 por os dois vizinhos CH ₂ protões. Da mesma forma, o CH ₂ é dividido em um quarteto com uma razão de intensidades de 1: 3: 3: 1 por três vizinhos CH ₃ protões. Em princípio, as duas CH ₂ protões também ser novamente dividida em um dupleto para formar um dubleto de quartetos pelo protão hidroxilo, mas troca intermolecular do protão hidroxilo ácida muitas vezes resulta em uma perda de acoplamento de informações.

Acoplar a qualquer spin ½ núcleos como o fósforo-31 ou flúor-19 obras nesta moda (embora as magnitudes das constantes de acoplamento pode ser muito diferente). Mas os padrões de desdobramento diferem daqueles descritos acima para os núcleos com spin maior do que o ½ porque número de spin quântico tem mais de dois valores possíveis. Por exemplo, o acoplamento de deutério (um núcleo de spin 1) divide o sinal em um 1: 1: 1 tripleto porque a rotação 1 tem três estados de spin. Do mesmo modo, um núcleo de spin 3/2 divide um sinal em um 1: 1: 1: 1 quarteto e assim por diante.

Acoplamento combinado com o desvio químico (e a integração, para protões) indicam não só sobre o ambiente químico dos núcleos, mas também o número de núcleos activos RMN vizinhas dentro da molécula. Em mais espectros complexo com vários picos a desvios químicos em espectros semelhantes, ou de outros núcleos de hidrogénio, acoplamento é frequentemente a única maneira para distinguir diferentes núcleos.

De segunda ordem (ou forte) de acoplamento

A descrição anterior assume que a constante de acoplamento é pequena em comparação com a diferença de frequências entre as rotações RMN inequivalent. Se a separação mudança diminui (ou a força de acoplamento aumenta), os padrões de intensidade multipleto estão distorcidas em primeiro lugar, e, em seguida, tornar-se mais complexa e menos facilmente analisados (especialmente se mais de dois spins estão envolvidos). Intensificação de alguns picos em um multipleto é conseguida à custa da restante, o que por vezes quase desaparecer no ruído de fundo, embora a área integrada sob os picos permanece constante. Em mais alto campo de RMN, no entanto, as distorções são geralmente modestos e as distorções características (coberturas) podem de facto ajudar a identificar picos relacionados.

Efeitos de segunda ordem diminuir à medida que a diferença de freqüência entre multiplets aumenta, de modo que de alto campo (ou seja, alta-frequência) visor espectros de RMN menos distorções do que espectros de freqüência mais baixa. Espectros início em 60 MHz eram mais propensas a distorção do que os espectros de máquinas posteriores normalmente operando em frequências de 200 MHz ou superior.

Falta de equivalência Magnética

Efeitos mais subtis pode ocorrer se quimicamente rotações equivalentes (isto é, núcleos relacionados por simetria e por isso ter a mesma frequência RMN) têm diferentes relações de acoplamento para rotações externos. Spins que são quimicamente equivalente mas não são indistinguíveis (com base em suas relações de acoplamento) são denominados magneticamente inequivalent. Por exemplo, os sites de 4 H de 1,2-diclorobenzeno dividir em dois pares quimicamente equivalentes por simetria, mas um membro individual de um dos pares tem diferentes acoplamentos para os spins que compõem o outro par. Falta de equivalência magnética pode levar a espectros altamente complexo, que só pode ser analisado por modelação computacional. Tais efeitos são mais comuns nos espectros de RMN de sistemas não-flexíveis aromáticos e outros, enquanto a média conformacional sobre ligações CC em moléculas flexíveis tende a igualar as uniões entre prótons em carbonos adjacentes, reduzindo problemas com falta de equivalência magnético.

Espectroscopia de correlação

Espectroscopia de correlação é um dos vários tipos de duas dimensões de ressonância magnética nuclear (RMN) ou espectroscopia 2D-RMN. Este tipo de experimento de RMN é mais conhecido por seu acrônimo, COSY. Outros tipos de RMN bidimensional incluem J-, espectroscopia de câmbio (EXSY), Espectroscopia de efeito nuclear de Overhauser (NOESY), espectroscopia de correlação total (TOCSY) e experiências de correlação heteronuclear, tal como HSQC, HMQC, e HMBC. Os espectros de RMN bidimensionais fornecer mais informações sobre uma molécula de espectros de RMN unidimensional e são especialmente úteis para determinar a estrutura de uma molécula , em particular para moléculas que são demasiado complicados para trabalhar com o uso de RMN unidimensional. A primeira experiência bidimensional, COSY, foi proposto por Jean Jeener, professor na Université Libre de Bruxelles, em 1971. Esta experiência foi mais tarde implementado por Walter P. Aue, Enrico e Bartholdi Richard R. Ernst, que publicou seu trabalho em 1976.

Ressonância magnética nuclear de estado sólido

Uma variedade de circunstâncias físicas não permitem que as moléculas a ser estudado em solução, e, ao mesmo tempo, não por outras técnicas espectroscópicas a um nível atómico, ou. Em meios de fase sólida, tais como cristais, pós microcristalinas, géis, soluções anisotrópicas, etc., é em particular o acoplamento dipolar e química deslocamento anisotropia que tornar-se dominante em relação ao comportamento dos sistemas de spin nuclear. Na espectroscopia de NMR de estado solução convencional, estas interacções adicionais conduziria a um alargamento significativo de linhas espectrais. Uma variedade de técnicas permite estabelecer condições de alta resolução, que pode, pelo menos para ¹³ espectros de C, ser comparável à solução espectros de RMN de estado.

Dois conceitos importantes para a alta-resolução espectroscopia de RMN de estado sólido são a limitação da possível orientação molecular pela orientação da amostra, ea redução das interações magnéticas anisotrópicas nucleares por amostra de fiação. Da última abordagem, rápido girando em torno do ângulo mágico é um método muito proeminente, quando o sistema compreende girar meia núcleos. Um número de técnicas intermédios, com amostras de alinhamento parcial ou com mobilidade reduzida, está actualmente a ser utilizada em espectroscopia de RMN.

Aplicações em que ocorrem efeitos de RMN de estado sólido estão frequentemente relacionadas com estruturar investigações sobre as proteínas da membrana, fibrilas de proteína ou todos os tipos de polímeros, e análises químicas em química inorgânica, mas também incluem aplicações "exóticos", como as folhas de plantas e células de combustível.

Espectroscopia de RMN Biomolecular

Proteínas

Grande parte da inovação dentro de espectroscopia de RMN foi dentro do campo de proteínas Espectroscopia de RMN, uma técnica importante no biologia estrutural. Um objectivo comum destas investigações é a obtenção de estruturas de alta resolução 3-dimensional da proteína, semelhante ao que pode ser conseguido através A cristalografia de raios-X. Em contraste com a cristalografia de raios X, espectroscopia de RMN é normalmente limitada a proteínas mais pequenas do que 35 kDa, embora estruturas maiores foram resolvidos. Espectroscopia de RMN é muitas vezes a única forma de obter informações de alta resolução na parcial ou totalmente proteínas intrinsecamente não-estruturados. É agora uma ferramenta comum para a determinação de Conformação Actividade Relações onde a estrutura antes e depois de uma interacção com, por exemplo, um candidato a fármaco é comparada com a sua actividade bioquímica conhecida. As proteínas são ordens de magnitude maior do que as pequenas moléculas orgânicas discutidas anteriormente neste artigo, mas as técnicas básicas de RMN e parte da teoria de RMN também se aplica. Devido ao muito maior número de átomos presentes numa molécula de proteína, em comparação com um composto orgânico pequeno, os espectros de 1D básicos tornar-se cheio com sobreposição de sinais para um ponto em que a análise espectros directa torna-se insustentável. Portanto, as experiências multidimensionais (2, 3 ou 4D) foram concebidas para lidar com este problema. Para facilitar estas experiências, é desejável isotopicamente marcar a proteína com ¹³ C e ^{15 N,} por causa predominante o isótopo ¹² C que ocorre naturalmente não é RMN-activo, ao passo que o momento de quadrupolo nuclear do composto que ocorre naturalmente predominante ¹⁴ N isótopo impede informação de alta resolução para ser obtido a partir deste isótopo de azoto. O método mais importante utilizado para a determinação da estrutura de proteínas utiliza Experiências NOE para medir distâncias entre pares de átomos dentro da molécula. Subsequentemente, as distâncias obtidas são utilizadas para gerar uma estrutura 3D da molécula através da resolução de um problema geometria de distância.

Ácidos nucleicos

"Nucleic Acid RMN" é a utilização de espectroscopia de RMN para se obter informações sobre a estrutura e dinâmica das poli ácidos nucleicos, tais como ADN ou ARN. A partir de 2003, quase a metade de todas as estruturas de RNA conhecido tinha sido determinado por espectroscopia de RMN.

O ácido nucleico e proteína espectroscopia de RMN são semelhantes, mas existem diferenças. Os ácidos nucleicos tem uma menor percentagem de átomos de hidrogénio, que são os normalmente observados em átomos de espectroscopia de RMN, e porque ácido nucleico hélices duplas são duras e aproximadamente linear, eles não dobrar sobre si mesmos para dar correlações de "longo alcance". Os tipos de RMN normalmente feito com ácidos nucleicos são ¹ H ou de RMN de protões, ¹³ C RMN, RMN ¹⁵ N, e ³¹ P RMN. Bidimensional métodos de RMN são quase sempre usados, tais como espectroscopia de correlação (COSY) e espectroscopia de transferência coerência total (TOCSY) para detectar através de-bond acoplamentos nucleares, e espectroscopia nuclear efeito de Overhauser (NOESY) para detectar os acoplamentos entre os núcleos que estão próximos uns dos outros no espaço.

Parâmetros tomadas a partir do espectro, principalmente picos cruzados e NOESY as constantes de acoplamento, pode ser usado para determinar as características estruturais, tais como locais ângulos de ligação glicosídicas, ângulos diedros (usando o Equação Karplus), e pucker açúcar conformações. Para a estrutura de grande escala, esses parâmetros locais devem ser complementadas com outras hipóteses ou modelos estruturais, porque os erros somam como a dupla hélice é atravessado, e ao contrário de proteínas, a dupla hélice não tem um interior compacto e não se dobra para trás em cima si. RMN também é útil para investigar geometrias não padronizados tais como hélices dobradas,-Watson-Crick não emparelhamento de bases, e empilhamento coaxial. Tem sido especialmente útil na sondagem da estrutura de oligonucleótidos de ARN naturais, as quais tendem a adoptar conformações complexas tais como estaminais-loops e pseudoknots. RMN também é útil para sondar a ligação de moléculas de ácido nucleico a outras moléculas, tais como proteínas ou fármacos, vendo que as ressonâncias são deslocados por ligação da outra molécula.

Os hidratos de carbono

Espectroscopia de RMN Carboidratos aborda questões sobre a estrutura e conformação de carboidratos .